Unikátní metoda vědců z UK odhalí onemocnění ledvin ****************************************************************************************** * Unikátní metoda vědců z UK pomáhá odhalit onemocnění ledvin ****************************************************************************************** Ve spolupráci s týmem Broad Institute – jednoho z nejvýznamnějších světových center geneti vedeného Ericem Landerem – přispěl tým Ing. Stanislava Kmocha z Ústavu dědičných metabolic 1. lékařské fakulty UK k objasnění genetické a molekulární příčiny onemocnění, které vede postupné ztrátě funkce ledvin. Nové poznatky mají nejenom významné klinické dopady, ale zá i na slabá místa moderních technik analýzy lidského genomu. Práce byla přijata k publikaci genetickém časopise Nature Genetics. Vaše práce odhaluje slabiny moderních metod analýzy genomu. Jakým směrem se budou po vašem projekty, ve kterých použití těchto moderních technik nebylo úspěšné? Když dnes hledáme příčinu dědičně podmíněného onemocnění, snažíme se nejprve získat účelno o genetické informaci (sekvenci DNA) postižených jedinců a jejich příbuzných. Následně por genetické informace s tzv. referenční sekvencí lidského genomu hledáme sekvenční odchylky Nalezené sekvenční varianty dále analyzujeme ve smyslu jejich výskytu v různých populacích funkční závažnosti a biologické konzervovanosti. Mezi takto analyzovanými variantami, kter jednom projektu i několik tisíc, vyhledáváme takové, které splňují podmínky očekávaného mo onemocnění a mají jistou funkční spojitost se studovaným fenotypem. Takto definované kandi dále funkčně charakterizujeme a snažíme se prokázat jejich skutečnou kauzální úlohu. Od tohoto obecného přístupu všichni očekávají, že vyřeší relativně rychle významnou většin podmíněných onemocnění. Praxe však ukazuje, že se nám ve více než polovině projektů, které kandidátní ani kauzální mutace nalézt. Publikovaná práce naznačuje, že jednou z příčin neúspěchu mohou být právě mutace lokalizov se vyskytujících sekvencích – repetetivních oblastech DNA. Současné metody sekvenace nám n tyto rozsáhlé a sekvenčně nesmírně rozmanité oblasti lidského genomu správně analyzovat. P instrukce, jak postupovat při vyhledávání a analýze těchto oblastí v doposud neúspěšných p Zajímavé je v tomto směru využití tradičních technik molekulární biologie – např. kombinac analýzy DNA (tzv. Southern blotu), klonování a Sangerova sekvenování –, od kterých se post genomických laboratořích ustupuje. Proč se moderní metody analýzy genomu nehodí pro analýzu repetetivních sekvencí? Repetetivní sekvence jsou velmi dynamické oblasti genomu. Mají různý rozsah – od dvou nukl tisíc nukleotidů. Během replikace DNA se různě kopírují, prodlužují, přesouvají se z místa převracejí. Během těchto procesů dochází ke změnám – mutacím –, které mohou mít v řadě pří význam. Aktuální metody sekvenování genomu jsou založeny na paralelní sekvenaci stovek milionů krá DNA (50–200 nukleotidů) a na následném počítačovém porovnávání a přikládání jednotlivých s referenční sekvenci. V případě repetetivních sekvencí příslušný počítačový program neví, k genomu jednotlivou sekvenci přiložit, a ve většině případů ani běžně používaná referenční oblasti neobsahuje. Výsledkem je, že jsou tyto sekvence z následné analýzy vyloučeny. Prot těchto případech vrátit ke starším metodám nebo čekat na novou technologii, která nám umož mnohem delší fragmenty DNA než doposud. O nalezení genetické příčiny medulárního cystického onemocnění ledvin typu I (MCKD1) se po již řadu let. Jak dlouho jste pracovali na projektu? Této problematice se věnujeme od roku 1997, kdy jsme začali studovat rodiny s dědičně se v a postižením ledvin. Po prvních úspěších – zejména po publikaci lokalizaci jednoho z genů v roce 2000 – jsme začali dostávat řadu vzorků s tímto onemocněním z různých míst na světě onemocněním. Výzkum byl mimo jiné částečně podpořen v roce 2008 grantem Grantové agentury Z dnešního pohledu a z hlediska hodnocení vědy obecně je zajímavé, že ač jsme použili všec dostupné a navržené metody, a řešení nevedlo k úspěchu, byl grant hodnocen jako nesplněný, písemnou výtku. Dlouhé roky se vědělo, že gen a jeho mutace musejí být lokalizovány v oblasti 2 milionů bá 1. Na jeho nalezení pracovala řada týmů dlouhé roky, ale žádný z nich nebyl schopen kauzál To se podařilo až Eriku Landerovi, Marku Dalymu a jejich skutečně mimořádně schopnému týmu technologickém zázemí, které je na Broad Institute k dispozici. Zcela zásadní úlohu v proj Anthony Bleyer, náš dlouholetý kolega a výzkumný partner z Nefrologické kliniky Wake Fores shromáždil unikátní soubor pacientů, který byl kritickým východiskem pro úspěšné vyřešení Jak přispěla právě vaše skupina k tomuto výsledku? Tak jako ostatní skupiny jsme dlouhodobě neúspěšně analyzovali vzorky DNA, které jsme měli s použitím všech dostupných genetických technik. Paralelně s tímto přístupem jsme se však mutovaný protein pomocí imunohistochemické detekce. V bioptických vzorcích ledvin jsme ana proteiny, které jsou přítomné v tubulárních buňkách ledvin. Na základě těchto experimentů jsme dlouho tušili, že oním proteinem musí být mucin-1. Měli pozorování u pacientů z našeho souboru, která ukazovala na změnu exprese tohoto proteinu. ani žádný jasný histopatologický závěr jsme však nebyli schopni nikdy nalézt. Dnes již vím důsledku mutace totiž vzniká úplně nový typ proteinu, který jsme našimi postupy nemohli dř nalezení kauzální mutace a odhalení základního dopadu mutace na strukturu mucimu-1 jsme vš rychle navrhnout a připravit protilátku, jež mutovaný protein v řadě biopsií specificky pr Naše analýza tak potvrdila výsledky genetické analýzy kolegů z Broad Institute a naznačila patogenetické mechanismy postupného snižování funkce tubulárních buněk ledvin. Jako v řadě podobných projektů se nám opět potvrdilo, že molekulárně patologický přístup ke studiu gen onemocnění, směr, který dlouhá léta rozvíjel profesor Milan Elleder, je jednou z velkých p našeho pracoviště. Právě díky tomuto přístupu, který koreluje genetické, biochemické a mol s patologií buňky a orgánu, se nám daří odhalovat nové poznatky o příčinách onemocnění a f patofyziologických mechanismech u člověka. Jakým způsobem pomůže objev při léčbě pacientů? MCKD1 se nedá klinicky určit. Diagnóza je možná pouze na základě genetického vyšetření neb imunohistochemické analýzy. Dokud nebylo možné tato vyšetření provést, nikdo nevěděl, kdo onemocněním trpí a jak se vlastně toto onemocnění projevuje. To je dnes možné a my víme o postižených rodin a stovkách pacientů na všech kontinentech. „Program UNCE je jedno z nejsmysluplnějších opatření na podporu vědy na Univerzitě Karlově Medulární cystické onemocnění ledvin (MCKD1) patří podobně jako polycystóza do skupiny děd vyskytuje v rodinách opakovaně v několika generacích a u přímých příbuzných (strýců, tet,